目的:构建人骨生成诱导因子基因(osteoinductive factor, OIF)慢病毒载体, 并在人主动脉平滑肌细胞(human aorticsmooth muscle cell, HASMC)中稳定过表达OIF。方法:PCR扩增OIF-3FLAG, 并克隆到慢病毒载体pMSCV PIG中, 构建慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG, 并测序鉴定。应用脂质体将pMSCV PIG-OIF-3FLAG或pMSCV PIG与VSVG、GAG-POL共转染293T细胞, 48 h后收集细胞上清, 感染HASMC, 48 h后加入嘌呤霉素4 d, 即筛选出稳定过表达pMSCV PIG-OIF-3FLAG的HASMC细胞株, 采用real-time PCR和Western blot检测OIF mRNA和蛋白表达。结果:构建OIF基因慢病毒表达载体pMSCV PIG-OIF-3FLAG, 经酶切及测序后证实目的基因的插入位点和读码框正确;包装病毒感染HASMC, 经real-time PCR和Western blot检测证实OIF mRNA和蛋白水平在该细胞株中高表达。结论:成功构建人OIF基因的慢病毒载体, 并获得稳定过表达该基因的HASMC。

目的 建立人脐静脉内皮细胞（HUVECs）内质网应激细胞模型，观察黄连碱对HUVECs以及内质网模型细胞生长活性的影响，对CHOP、GRP78基因以及蛋白表达的影响。方法 使用10 μg/mL的衣霉素诱导HUVECs 18 h后，加入不同浓度的黄连碱再处理24 h。CCK8法检测不同浓度黄连碱对HUVECs的活性影响以及黄连碱对衣霉素诱导后的HUVECs的活性影响；采用RT-RCR法比较各组细胞中CHOP、GRP78的mRNA的表达情况；采用Western blotting和细胞免疫荧光法比较各组细胞中CHOP，GRP78的蛋白表达情况。结果 随着黄连碱浓度的增加，在1~20 μmol/L范围内的黄连碱对HUVECs的活性无影响，浓度为20 μmol/L黄连碱作用24 h后，对衣霉素诱导的HUVECs活性具有保护作用（P < 0.01）。加入衣霉素诱导18 h，HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平的表达增高（P < 0.01），再加入黄连碱继续诱导24 h后，黄连碱可以抑制衣霉素所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平的表达增高（P < 0.01）。加入衣霉素诱导18 h，HUVECs中CHOP、GRP78蛋白水平的表达增高（P < 0.01），再加入黄连碱继续诱导24 h后，发现黄连碱可以抑制衣霉素所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78蛋白水平的表达增高（P < 0.01），与衣霉素诱导组相比数据具有统计学意义，细胞免疫荧光染色结果与Western blotting结果相似。结论 黄连碱可以减轻由衣霉素诱导的HUVECs过度内质网应激反应，并可提高受损细胞的活性；并可通过下调CHOP、GRP78的表达改善HUVECs过度内质网应激反应。

目的用油酸和棕榈酸处理HepG2细胞构建脂肪肝细胞模型，观察黄连碱（COP）对脂肪肝细胞中脂质蓄积的影响及其作用机制。方法采用100 μmol/L油酸和50 μmol/L棕榈酸诱导HepG2细胞脂肪变性形成细胞内脂质蓄积，构建脂肪肝细胞模型；通过CCK8检测不同浓度的黄连碱对HepG2细胞增殖活性的影响，设置4组细胞模型：对照组、脂肪肝细胞模型组（FFA组）、COP+HepG2组以及COP+FFA组；通过RT-PCR和Western blotting检测3组细胞的自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG5及胆固醇外流介导因子ABCA1 mRNA及蛋白水平的表达变化；采用油红O染色观察对照组、FFA组和COP+FFA组3组细胞的脂滴变化。结果油红O染色结果显示相较于对照组，HepG2细胞经过油酸和棕榈酸共同处理后的FFA组细胞内脂质明显增多；而COP+FFA组中细胞的脂滴明显减少。CCK8结果显示0~25 μmol/L的黄连碱对HepG2细胞活性无明显影响（P>0.05）。Western blotting与RT-PCR结果显示：相对于对照组，FFA组细胞自噬以及胆固醇外流ABCA1水平明显降低，而COP+HepG2组自噬基因LC3Ⅰ/Ⅱ和ATG5以及ABCA1表达水平明显升高；相对于FFA组，COP+FFA组细胞中脂质蓄积明显减少，差异均有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01），且自噬与胆固醇外流障碍也被改善。结论黄连碱可通过促进HepG2细胞自噬及胆固醇外流，减少油酸与棕榈酸诱导形成的脂肪肝细胞中的脂质蓄积。